瀏覽數(shù)量： 0 作者： 本站編輯 發(fā)布時(shí)間： 2024-05-15 來源： 本站
只有做過WB的人才會(huì)知道WB有多容易翻車?。?！“科研生涯走過最長的路，就是WB實(shí)驗(yàn)的彎路...”，我想把自己總結(jié)的一些經(jīng)驗(yàn)分享給大家。
#01-制樣
1. 為確保樣本蛋白質(zhì)免于降解，采取取材后立即于液氮環(huán)境下實(shí)施快速冷凍處理，隨后貯存于-80℃恒溫冷柜中。在此過程中，務(wù)必配置與之對應(yīng)批次的陽性對照樣本
2. 研磨組織：研磨充分，根據(jù)重量加裂解液（1:10）超聲1min，置于冰上裂解30min。
裂解后：①觀察裂解液是否粘稠，粘稠原因可能是沒打超聲，或者是裂解液量不夠，需要補(bǔ)加裂解液；
②離心后觀察上清是否澄清，下面是否有白色沉淀，如果比較大塊的話也是沒有裂解好。較軟組織稱重后按比例加入裂解液，使用手持研磨儀研磨，較韌組織使用液氮低溫研磨。
3. 進(jìn)行蛋白定量時(shí)，推薦采用BCA（ bicinchoninic acid assay）法。在進(jìn)行BCA測定前，應(yīng)對蛋白原液進(jìn)行充分渦旋混勻，以確保樣本均勻性。取樣時(shí)，應(yīng)選取管中部的液體進(jìn)行檢測，以代表整體蛋白濃度。此外，為提高測定的準(zhǔn)確性和可信度，務(wù)必設(shè)置重復(fù)孔（復(fù)孔）進(jìn)行平行測量。
4. 配置體系：按照蛋白原液的量來配置體系，配置前一定要看清組別和體積，精力需集中，防止加錯(cuò)，配置后渦旋，煮樣，記得要把樣本加到液面下，不要滴在蓋子。
5. 制備好的樣品暫不使用時(shí)，立即放入-20℃冰箱保存。
#02-電泳
1. 電泳液混勻后使用，液面過短玻板，建議用新液，嚴(yán)防槽漏。
2. 提前制膠時(shí)玻璃板一定要洗凈，否側(cè)會(huì)影響你的電泳哦。配膠的時(shí)候一定要充分混勻，（可以適當(dāng)超聲一下，不要太久），加完分離膠后可以加入純化水等壓平分離膠，這樣分離膠就會(huì)凝成一條直線（這個(gè)我覺得很重要），膠凝得不好，后面跑出的條帶會(huì)很丑。
3. 一般跑20min左右溴酚藍(lán)會(huì)被壓成一條直線，前20 分鐘一定要觀察，如果發(fā)現(xiàn)溴酚藍(lán)跑歪了，及時(shí)暫停檢查內(nèi)槽是否漏液、蓋子是否蓋好，前20min還能拯救一下的。
4. 電泳期間觀察是否有發(fā)熱現(xiàn)象。
5. 上樣前渦旋相同次數(shù)，記得設(shè)置同批次的陽性對照。
6. 上樣時(shí)緩慢一點(diǎn)，盡量讓每個(gè)孔內(nèi)樣本時(shí)水平升起，不要在孔的左右角用力加樣，否則會(huì)因?yàn)槟z孔不均出現(xiàn)啞鈴條帶。
7. 煮好的樣本-20℃拿出來后，上樣前使用變形溫度煮3min，更加穩(wěn)定。
#03-電轉(zhuǎn)
1. 三明治結(jié)構(gòu)夾緊，濾紙起毛之后及時(shí)更換，顯影后出現(xiàn)兩邊重，中間淺，可能是轉(zhuǎn)膜夾子太緊，或者不平整導(dǎo)致的。
2. 電轉(zhuǎn)液渾濁后換新的。
3. 安裝夾子的時(shí)候需小心，否則膜可能會(huì)移位，導(dǎo)致蛋白丟失。
4. 電泳期間要冰水浴，盒內(nèi)也要加冰盒或者冰塊（建議加冰塊），防止發(fā)熱，過熱會(huì)損傷
5. 蛋白。
#04-封閉及孵育
1. 封閉時(shí)間2h左右適宜，時(shí)間過少會(huì)導(dǎo)致非特異性結(jié)合位點(diǎn)多，背景臟；時(shí)間過長，信號低。
2. 孵育磷酸化的蛋白時(shí)，推薦使用2%BSA，脫脂牛奶可能會(huì)導(dǎo)致信號丟失。
3. 一抗的孵育時(shí)間16-24h，過短可能會(huì)導(dǎo)致抗原抗體結(jié)合不充分從而致使信號丟失。
4. 洗膜，短時(shí)間多次，勤換TBST，若洗脫效果不好，可以多加一點(diǎn)Tween20.
5. 所有液體不要直接沖到膜上，從容器的邊緣加，或者慢慢從膜的邊緣加。
#05-曝光
2. 如果條帶信號較低，使用靈敏度較高的發(fā)光液、延長曝光。考慮：封閉過度、提高一抗?jié)舛取⒎跤龝r(shí)間、二抗?jié)舛忍岣摺?/p>
3. 如果出現(xiàn)黑一塊白一塊的現(xiàn)象，發(fā)光液不均勻?qū)е碌?/p>
